Flexibility in PAM recognition expands DNA targeting in xCas9

Kazi A Hossain; Łukasz Nierzwicki; Modesto Orozco; Jacek Czub; Giulia Palermo

doi:10.7554/elife.102538.3

Flexibility in PAM recognition expands DNA targeting in xCas9

Abstrakt

xCas9 is an evolved variant of the CRISPR-Cas9 genome editing system, engineered to improve specificity and reduce undesired off-target effects. How xCas9 expands the DNA targeting capability of Cas9 by recognising a series of alternative protospacer adjacent motif (PAM) sequences while ignoring others is unknown. Here, we elucidate the molecular mechanism underlying xCas9’s expanded PAM recognition and provide critical insights for expanding DNA targeting. We demonstrate that while wild-type Cas9 enforces stringent guanine selection through the rigidity of its interacting arginine dyad, xCas9 introduces flexibility in R1335, enabling selective recognition of specific PAM sequences. This increased flexibility confers a pronounced entropic preference, which also improves recognition of the canonical TGG PAM. Furthermore, xCas9 enhances DNA binding to alternative PAM sequences during the early evolution cycles, while favouring binding to the canonical PAM in the final evolution cycle. This dual functionality highlights how xCas9 broadens PAM recognition and underscores the importance of fine-tuning the flexibility of the PAM-interacting cleft as a key strategy for expanding the DNA targeting potential of CRISPR-Cas systems. These findings deepen our understanding of DNA recognition in xCas9 and may apply to other CRISPR-Cas systems with similar PAM recognition requirements.

Cytowania

0

CrossRef
0

Web of Science
0

Scopus

Autorzy (5)

Kazi A Hossain
Łukasz Nierzwicki
Modesto Orozco
Jacek Czub prof. dr hab. inż.
Giulia Palermo dr

Cytuj jako

Pełna treść

pobierz publikację

pobrano 1 razy

Wersja publikacji: Accepted albo Published Version
DOI:: Cyfrowy identyfikator dokumentu elektronicznego (otwiera się w nowej karcie) 10.7554/eLife.102538.3
Licencja: otwiera się w nowej karcie

pełna treść artykułu zobacz w serwisie zewnętrznym otwiera się w nowej karcie

Słowa kluczowe

Informacje szczegółowe

Kategoria:

Publikacja w czasopiśmie

Typ:

artykuły w czasopismach dostępnych w wersji elektronicznej [także online]

Opublikowano w:

eLife
ISSN: 2050-084X

Język:

angielski

Rok wydania:

2025

Opis bibliograficzny:

Hossain K. A., Nierzwicki Ł., Orozco M., Czub J., Palermo G., Flexibility in PAM recognition expands DNA targeting in xCas9, eLife, 2025,10.7554/eLife.102538.3

DOI: