Fuzyjne polimerazy DNA – otrzymywanie, charakterystyka i zastosowanie - Publikacja - MOST Wiedzy

Wyszukiwarka

Fuzyjne polimerazy DNA – otrzymywanie, charakterystyka i zastosowanie

Abstrakt

Obecnie reakcje PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) wykazują bardzo szerokie zastosowanie w diagnostyce medycznej, biologii molekularnej czy inżynierii genetycznej. Efektywność tych reakcji rozumiana jako wydajność i wierność przeprowadzonej amplifikacji jest nieodłącznie związana ze stosowaną polimerazą DNA i warunkami prowadzenia reakcji PCR. Aby sprostać wymaganiom stawianym przez nowoczesne metody diagnostyczne oraz współczesną inżynierię genetyczną konieczne jest poszukiwanie polimeraz DNA o coraz lepszych właściwościach. Dotychczas wprowadzane modyfikacje amplifikacji DNA to przede wszystkim stosowanie udoskonalonych buforów, wzmacniaczy reakcji PCR, wprowadzanie mutacji w polimerazach DNA lub konstrukcje polimeraz chimerycznych. Coraz popularniejsze stają się również modyfikacje znanych już polimeraz DNA poprzez tworzenie ich fuzji z białkami mogącymi poprawić ich użyteczność. Podstawowym założeniem niniejszej pracy było otrzymanie nowej, lepszej polimerazy DNA jako wynik fuzji polimerazy DNA z białkiem wiążącymi jedno- lub dwuniciowe DNA i zbadanie jej nowych właściwości pod względem procesywności, termostabilności, powinowactwa do matrycy DNA, jak również odporności na inhibitory występujące w próbkach klinicznych (np. we krwi). Modyfikacjom została poddana najbardziej popularna w diagnostyce molekularnej polimeraza DNA z Thermus aquaticus z delecją reszt aminokwasowych tworzących domenę odpowiedzialną za aktywność egzonukleolityczną 5’→3’ (TaqStoffel). Natomiast białkami, które zastosowano do fuzji były białka mające naturalną zdolność do wiązania się z DNA: RB69SSB, TtePriB i NeqSSB oraz domena DBD ligazy P. furiosus. Cechy nowych polimeraz DNA porównano z polimerazą DNA TaqStoffel. Uzyskano polimerazy o ulepszonych podstawowych cechach, bardziej przydatnych do pracy z problematycznymi matrycami (długie i bogate w pary GC) oraz z próbkami, którym mogą towarzyszyć inhibitory z krwi (laktoferyna, heparyna). Ponadto wykazano wzrost termostabilności, procesywności i czułości fuzyjnych polimeraz DNA zwłaszcza w przypadku fuzji z białkiem SSB pochodzącym z Nanoarchaeum equitans (NeqSSB) oraz domeną DBD ligazy Pyrococcus furiosus.Zoptymalizowane i przeprowadzone doświadczenia pozwoliły również na wyznaczenie istotnych cech białek użytych w fuzji z polimerazą DNA (co może być istotne w racjonalnym projektowaniu innych fuzyjnych polimeraz DNA) oraz sposobu badania ich właściwości.

Cytuj jako

Pełna treść

pobierz publikację
pobrano 3154 razy
Wersja publikacji
Accepted albo Published Version
Licencja
Copyright (Author(s))

Słowa kluczowe

Informacje szczegółowe

Kategoria:
Doktoraty, rozprawy habilitacyjne, nostryfikacje
Typ:
praca doktorska pracowników zatrudnionych w PG oraz studentów studium doktoranckiego
Język:
polski
Rok wydania:
2018
Weryfikacja:
Politechnika Gdańska

wyświetlono 781 razy

Publikacje, które mogą cię zainteresować

Meta Tagi