Fuzyjne polimerazy DNA – otrzymywanie, charakterystyka i zastosowanie - Publikacja - MOST Wiedzy

Twoje konto

zaloguj

Wyszukiwarka

Fuzyjne polimerazy DNA – otrzymywanie, charakterystyka i zastosowanie

Abstrakt

Obecnie reakcje PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) wykazują bardzo szerokie zastosowanie w diagnostyce medycznej, biologii molekularnej czy inżynierii genetycznej. Efektywność tych reakcji rozumiana jako wydajność i wierność przeprowadzonej amplifikacji jest nieodłącznie związana ze stosowaną polimerazą DNA i warunkami prowadzenia reakcji PCR. Aby sprostać wymaganiom stawianym przez nowoczesne metody diagnostyczne oraz współczesną inżynierię genetyczną konieczne jest poszukiwanie polimeraz DNA o coraz lepszych właściwościach. Dotychczas wprowadzane modyfikacje amplifikacji DNA to przede wszystkim stosowanie udoskonalonych buforów, wzmacniaczy reakcji PCR, wprowadzanie mutacji w polimerazach DNA lub konstrukcje polimeraz chimerycznych. Coraz popularniejsze stają się również modyfikacje znanych już polimeraz DNA poprzez tworzenie ich fuzji z białkami mogącymi poprawić ich użyteczność. Podstawowym założeniem niniejszej pracy było otrzymanie nowej, lepszej polimerazy DNA jako wynik fuzji polimerazy DNA z białkiem wiążącymi jedno- lub dwuniciowe DNA i zbadanie jej nowych właściwości pod względem procesywności, termostabilności, powinowactwa do matrycy DNA, jak również odporności na inhibitory występujące w próbkach klinicznych (np. we krwi). Modyfikacjom została poddana najbardziej popularna w diagnostyce molekularnej polimeraza DNA z Thermus aquaticus z delecją reszt aminokwasowych tworzących domenę odpowiedzialną za aktywność egzonukleolityczną 5’→3’ (TaqStoffel). Natomiast białkami, które zastosowano do fuzji były białka mające naturalną zdolność do wiązania się z DNA: RB69SSB, TtePriB i NeqSSB oraz domena DBD ligazy P. furiosus. Cechy nowych polimeraz DNA porównano z polimerazą DNA TaqStoffel. Uzyskano polimerazy o ulepszonych podstawowych cechach, bardziej przydatnych do pracy z problematycznymi matrycami (długie i bogate w pary GC) oraz z próbkami, którym mogą towarzyszyć inhibitory z krwi (laktoferyna, heparyna). Ponadto wykazano wzrost termostabilności, procesywności i czułości fuzyjnych polimeraz DNA zwłaszcza w przypadku fuzji z białkiem SSB pochodzącym z Nanoarchaeum equitans (NeqSSB) oraz domeną DBD ligazy Pyrococcus furiosus.Zoptymalizowane i przeprowadzone doświadczenia pozwoliły również na wyznaczenie istotnych cech białek użytych w fuzji z polimerazą DNA (co może być istotne w racjonalnym projektowaniu innych fuzyjnych polimeraz DNA) oraz sposobu badania ich właściwości.

Autor (1)

Cytuj jako

Pełna treść

pobierz publikację
pobrano 2876 razy
Wersja publikacji
Accepted albo Published Version
Licencja
Copyright (Author(s))

Słowa kluczowe

Informacje szczegółowe

Kategoria:
Doktoraty, rozprawy habilitacyjne, nostryfikacje
Typ:
praca doktorska pracowników zatrudnionych w PG oraz studentów studium doktoranckiego
Język:
polski
Rok wydania:
2018
Bibliografia: test
  1. Aparatura i sprzęt laboratoryjny ................................................................................................... 44
  2. Odczynniki chemiczne ........................................................................................................................ 45
  3. Pożywki i podłoża mikrobiologiczne ........................................................................................... 46 otwiera się w nowej karcie
  4. Markery..................................................................................................................................................... 46
  5. Odczynniki do reakcji PCR................................................................................................................ 47
  6. Enzymy restrykcyjne i ich bufory do reakcji trawienia....................................................... 50
  7. Odczynniki do reakcji Gibsona ....................................................................................................... 50
  8. Odczynniki do rozdziału DNA za pomocą elektroforezy agarozowej ........................... 50 otwiera się w nowej karcie
  9. Odczynniki do rozdziału białek za pomocą elektroforezy poliakrylamidowej w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) ................................................................................... 51
  10. Bufory do oczyszczania białek ..................................................................................................... 52 12. Odczynniki do filtracji żelowej .................................................................................................... 53 13. Szczepy bakteryjne, DNA plazmidowe i genomowe .......................................................... 53 14. Odczynniki do izolacji genomowego DNA .............................................................................. 54 15. Odczynniki do izolacji plazmidowego DNA............................................................................ 54
  11. Odczynniki do oczyszczania DNA z żelu agarozowego i po reakcjach trawienia enzymatycznego ........................................................................................................................................ 54 17. Zestaw do oznaczania jednostkowości polimeraz DNA ................................................... 54
  12. Pozostałe bufory i roztwory ......................................................................................................... 55 METODY ................................................................................................................................................................. 56 1. Izolacja genomowego DNA ............................................................................................................... 56 2. Izolacja plazmidowego DNA ............................................................................................................ 56 3. Elektroforetyczny rozdział DNA w żelu agarozowym ......................................................... 56 otwiera się w nowej karcie
  13. Elektroforeza poliakrylamidowa białek w warunkach denaturujących SDS-PAGE 57 4.1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego ........................................................................ 57 4.2. Przygotowanie próbek do elektroforezy białkowej .................................................... 57 4.3. Barwienie i odbarwianie żeli poliakrylamidowych ..................................................... 57 otwiera się w nowej karcie
  14. Izolacja DNA z żelu agarozowego .................................................................................................. 57
  15. Oczyszczanie DNA po reakcjach enzymatycznych ................................................................ 57
  16. Amplifikacja genów kodujących fuzyjne polimerazy DNA ................................................ 58
  17. Reakcje trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi............................................................... 59
  18. Reakcja Gibsona .................................................................................................................................... 59 10. Hodowle bakteryjne ......................................................................................................................... 60 10.1. Hodowle w pożywce płynnej............................................................................................... 60 10.2. Hodowle na podłożu stałym ................................................................................................ 60 otwiera się w nowej karcie
  19. Transformacja komórek E. coli rekombinantowym DNA ................................................ 60 11.1 Przygotowanie komórek kompetentnych E. coli ......................................................... 60 11.2 Transformacja komórek kompetentnych E. coli .......................................................... 61
  20. Sprawdzenie obecności DNA insertu ........................................................................................ 61 12.1 Sprawdzenie obecności DNA insertu za pomocą analizy restrykcyjnej ............ 61 12.2 Sprawdzenie obecności DNA insertu za pomocą sekwencjonowania ............... 61
  21. Ekspresja genów kodujących białka fuzyjne ......................................................................... 62 13.1 Optymalizacja warunków ekspresji .................................................................................. 62 13.2 Ekspresja genów kodujących fuzyjne polimerazy DNA w objętości 1000 ml pożywki .................................................................................................................................................... 62
  22. Rysunek 41. Rozdział elektroforetyczny w 2% żelu agarozowym z bromkiem etydyny [Mat. 9, Met. 3] przedstawiający wyniki testu opóźnienia ruchliwości elektroforetycznej DNA w obecności polimeraz DNA NeqSSB-TaqS (A), DBD-TaqS (B), RB69SSB-TaqS (C), TtePriB-TaqS (D) oraz TaqS (E) z ssDNA oraz dsDNA. Mieszanina reakcyjna zawierała 10 pmol (dT76) oraz 2,5 pmol produktu PCR o długości 100 pz dla panelu A, B, C, D ścieżki oznaczają: otwiera się w nowej karcie
  23. Bartlett JMS, Stirling D. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. PCR Protocols. New Jersey: Humana Press; 2003; 226:3-6. otwiera się w nowej karcie
  24. Garibyan L, Avashia N. Polymerase chain reaction. J Invest Dermatol; 2013;133(3):1-4. otwiera się w nowej karcie
  25. Hubscher U, Spadari S, Villani G, Maga G. DNA polymerases Discovery, Characterization and Functions in Cellular DNA Transaction. World Scientific Publishing; 2010; 79-106. otwiera się w nowej karcie
  26. Fisher JK, Bourniquel A, Prentiss M, Kleckner N. DNA Replication, Recombination & Repair. Biophys J. 2011;7:394-738. otwiera się w nowej karcie
  27. Allen WJ, Li Y, Waksman G. Bacterial DNA Polymerase I. Encyclopedia of Life Sciences. Chichester, UK: John Wiley & Sons; 2010 otwiera się w nowej karcie
  28. Horning EC. Enzymic synthesis of deoxyribonucleic acid. 1956;21:5-6.
  29. Capson TL, Peliska JA, Fenn Kaboord B, West Frey M, Lively C, Dahlberg M, Bencovic SJ. Kinetic Characterization of the Polymerase and Exonuclease Activities of the Gene 43 Protein of Bacteriophage T4. Biochemistry. 1098;31:10984-94. otwiera się w nowej karcie
  30. Albà MM. Replicative DNA polymerases. Genome Biol. 2001;2(1):1-4. otwiera się w nowej karcie
  31. Wang J, Sattar AK, Wang CC, Karam JD, Konigsberg WH, Steitz TA. Crystal structure of a pol alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell. 1997;89(7):1087-99. otwiera się w nowej karcie
  32. Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T, Kai Y. Crystal structure of DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1. J Mol Biol. 2001;306(3):469-77. otwiera się w nowej karcie
  33. Huang YP, Ito J. DNA polymerase C of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus: classification and phylogenetic analysis of the family C DNA polymerases. J Mol Evol. 1999;48(6):756-69. otwiera się w nowej karcie
  34. Garcia-Diaz M, Bebenek K. Multiple functions of DNA polymerases. CRC Crit Rev Plant Sci. 2007;26(2):105-22. otwiera się w nowej karcie
  35. Sawaya MR, Pelletier H, Kumar A, Wilson SH, Kraut J. Crystal structure of rat DNA polymerase beta: evidence for a common polymerase mechanism. Science. 1994;264(5167):1930-5. otwiera się w nowej karcie
  36. Yamtich J, Sweasy JB. DNA polymerase Family X: Function, structure, and cellular roles. Biochim Biophys Acta -Proteins Proteomics. 2010;1804(5):1136- 50. otwiera się w nowej karcie
  37. Boudsocq F, Kokoska RJ, Plosky BS, Vaisman A, Ling H, Kunkel TA, Yang W, otwiera się w nowej karcie
  38. Biol Chem. 2004;279(31):32932-40. otwiera się w nowej karcie
  39. Lehmann AR. New Functions for Y Family Polymerases. Amsterdam: Elsevier Academic Press; 2005;93 otwiera się w nowej karcie
  40. Rothwell PJ, Waksman G. Structure and mechanism of DNA polymerases. Advances in protein chemistry. 2005;401-40. otwiera się w nowej karcie
  41. Delarue M, Poch O, Tordo N, Moras D, Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng. 1990;3(6):461-7. otwiera się w nowej karcie
  42. Al-soud WA, Rådström P. Capacity of Nine Thermostable DNA Polymerases To Mediate DNA Amplification in the Presence of PCR-Inhibiting Samples. Appl Environ Microbiol. 1998;64(10):3748-53.
  43. Oshima T, Imahori K. Description of Thermus thermophilus (Yoshida and Oshima) comb. nov., a Nonsporulating Thermophilic Bacterium from a Japanese Thermal Spa. Int J Syst Bacteriol. 1974;102-1. otwiera się w nowej karcie
  44. Patel PH, Suzuki M, Adman E, Shinkai A, Loeb LA. Prokaryotic DNA polymerase I: evolution, structure, and "base flipping" mechanism for nucleotide selection. J Mol Biol. 2001;308(5):823-37. otwiera się w nowej karcie
  45. Li Y, Korolev S, Waksman G. Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation. EMBO J. 1998;17(24):7514-25. otwiera się w nowej karcie
  46. Johnson K. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochim Biophys Acta -Proteins Proteomics. 2010;1804(5):1041- 8. otwiera się w nowej karcie
  47. Beese L, Steitz T. Structural basis for the 3'-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBO J. 1991;10(1):25-33. otwiera się w nowej karcie
  48. Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem. 1999;274(25):17395-8. otwiera się w nowej karcie