Abstract

Praca opisuje konstrukcję wydajnego systemu produkcji fimbrii Dr. System składa się z dwóch plazmidów. Plazmid pACYCpBAD-DraC-C-His zawiera pod kontrolą promotora arabinozowego gen draC kodujący białko kanałotwórcze DraC. Plazmid pET-30b-sygDraBE zawiera pod kontrolą promotora T7lac geny draB i draE kodujące odpowiednio białko opiekuńcze DraB oraz adhezynę DraE. Oba plzamidy posiadają różne ori replikacji co pozwala na ich jednoczesne występowanie w komórce bakteryjnej. Wykorzystanie dwóch różnych promotorów pozwala na prowadzenie kontrolowanej ekspresji z obu plazmidów. Skonstruowany system ekspresyjny charakteryzuje się dużą uniwersalnością i pozwala na prowadzenie badań nad mechanizmem biogenezy struktur adhezyjnych bakterii Gram-ujemnych. W pracy pokazano, że adhezyna AfaE-III (98,1% identyczności pomiędzy białkami AfaE-III i DraE odpowiadającej trzem różnicom w sekwencji aminokwasowej)ulega biogenezie przez szczep Escherichia coli BL21(DE3) kodujący białko kanałotwórcze DraC. Stosując technikę immunoblotingu oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej potwierdzono obecność adhezyny AfaE-III na powierzchni skonstruowanego szczepu bakteryjnego. Dodatkowo skonstruowany system ekspresyjny może być wykorzystany do produkcji chimerycznych fimbrii zawierających immunogenne sekwencje epitopowe. W pracy skonstruowano szczep produkujący chimeryczne fimbrie eksponujące heterologiczną sekwencję epitopową glikoproteiny D wirusa HSV1. Sekwencja epitopowa została wprowadzona w region N-terminalnej powierzchniowej domeny 2 białka DraE. Obecność chimerycznych fimbrii na powierzchni skonstruowanego szczepu potwierdzono techniką immunoblotingu i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Skonstruowany system ekspresyjny może być wykorzystany w badaniach nad konstrukcją szczepionek w postaci chimerycznych fimbrii.

Authors (3)