Abstract

Celem badań przedstawionych w rozprawie było określenie aktywności przeciwgrzybowej szeregu związków będących koniugatami peptydów z inhibitorami enzymatycznymi (FMDP, cispentacyna). Zakres badań obejmował zbadanie aktywności peptydów-FMDP, CPP oraz FMDP-CPP wobec grzybów z rodzaju Candida w różnego typu podłożach, określenie możliwości powstawania oporności na FMDP-CPP i peptydy-FMDP, a także określenie szybkości transportu i lokalizacji peptydów i ich koniugatów w komórkach. Wyniki badań wykazały wysoką aktywność koniugatów CPP z FMDP w podłożach minimalnych YNB, przy braku aktywności w podłożach bogatych, w tym w podłożu RPMI-1640. Zastosowanie cytometrii przepływowej oraz mikroskopii konfokalnej umożliwiło potwierdzenie wydajnego transportu znakowanych fluoresceiną peptydów P5 i F5 do komórek C. albicans oraz ich wewnątrzkomórkową akumulację w wakuolach. Dzięki przeprowadzonym badaniom zaobserwowano brak aktywności FMDP-CPP wobec innych niż C. albicans grzybów z rodzaju Candida. Zauważono również na podstawie eksperymentów wykorzystujących kliniczne wielolekooporne szczepy C. albicans, że badane peptydy penetrujące z FMDP na N-końcu nie są substratami dla pomp wielolekowych. Wykazano ponadto, że działanie koniugatów FMDP-CPP na komórki C. albicans nie indukuje tworzenia tzw. spontanicznych mutantów opornych. Istotne informacje uzyskano badając aktywność i zdolność transportu związków wobec szeregu mutantów delecyjnych szczepu C. albicans SC5314. Mutant opt12345ptr222Δ pozbawiony istotnych genów kodujących permeazy peptydowe, okazał się niewrażliwy na działanie badanych FMDP-CPP, co może sugerować, że peptydy te są transportowane do komórek przez te permeazy. Jedynie w przypadku koniugatu FMDP z oktaargininą stwierdzono, że jego działanie przeciwgrzybowe jest niezależne od obecności permeaz peptydowych, co wskazuje na działanie oktaargininy jako rzeczywistego nośnika o charakterze CPP. W wyniku badania przesiewowego komórek izolowanych z kolonii wyrastających wewnątrz stref wzrostu zahamowanego przez działanie Nva-FMDP lub Lys-Nva-FMDP stwierdzono, że dla znakomitej większości z nich (97%) nie występuje trwała oporność. Zidentyfikowano trzy izolaty trwale oporne na działanie Nva-FMDP i Lys-Nva-FMDP. Oporność tych izolatów jest związana z brakiem transportu badanych związków, di- i tripeptydów przez permeazy PTR, prawdopodobnie w wyniku zmian w obrębie genów strukturalnych lub regulatorowych.

Author (1)