Abstract

Białko MutS wiąże DNA zawierające błędnie sparowane oraz niesparowane zasady w DNA. Podjęto szereg prób wykorzystania tego białka jako narzędzia do detekcji nieznanych mutacji lub zagęszczania frakcji DNA z niesparowaną zasadą. Dotychczas żadna z metod oparta na użyciu białka MutS nie została wdrożona powszechnie do praktyki laboratoryjnej. Głównym powodem takiego stanu rzeczy jest stosunkowo silne powinowactwo MutS do DNA w pełni komplementarnego, a próby osłabienia tego oddziaływania obniżają znacząco wiązanie z niesparowanymi zasadami. O ile wobec rozwoju technik analizy DNA, zwłaszcza sekwencjonowania, użycie MutS do wykrywania mutacji nie wydaje się już praktyczne, to metoda wychwytywania fragmentów DNA zawierających niesparowane zasady może być przydatna albo do usuwania zmutowanych sekwencji albo do oznaczania rzadkich wariantów sekwencji nukleotydowej, jak np. w wypadku mutacji somatycznych lub zmian premutacyjnych. yło zbadanie przydatności immobilizowanego białka MutS do wzbogacania frakcji fragmentów DNA zawierającego niesparowane lub błędnie sparowane zasady. Kluczowe elementy badań stanowiły (i) dobór białka MutS (ii); opracowanie warunków immobilizacji białka i wiązania DNA; (iii) ocena efektywności wzbogacania frakcji DNA zawierającej niesparowane i błędnie sparowane zasady. Przeprowadzone po raz pierwszy w świecie badania in vitro rekombinantowego białka MutS z D. radiodurans, wykonane w ramach tej pracy, wykazały, że homolog ten w stosowanych układach eksperymentalnych przewyższa znacząco efektywnością i specyficznością wiązania fragmentów DNA zawierających niesparowane MutS z E. coli i T. thermophilus. Przeprowadzono także pionierską próbę identyfikacji zmian premutacyjnych w genomowym DNA. Na płytkę z immobilizowanym białkiem MutS nanoszono DNA genomowe myszy potrawione enzymem restrykcyjnym, po czym fragmenty wychwycone przez MutS analizowano metodą sekwencjonowania drugiej generacji NGS. Najważniejsze osiągnięcia przedstawione w tej dysertacji to opracowanie nowego, efektywnego sposobu wzbogacania frakcji DNA zawierającej niesparowane zasady przy użyciu immobilizowanego białka MutS i wykazanie, że w stosowanych warunkach oznaczenia in vitro białko MutS z D. radiodurans w sposób bardziej efektywny i specyficzny rozpoznaje niesparowane zasady w DNA niż homologi MutS z E. coli i T. thermophilus.

Author (1)