Abstract

Enzymy lipolityczne ze względu na swoje unikalne właściwości takie jak stereo-, chemo- i regiospecyficzność znajdują szereg zastosowań w różnych gałęziach przemysłu. Lipazy i esterazy wykorzystywane są w przemyśle chemicznym, farmaceutycznym, spożywczym oraz w syntezie organicznej. W ramach wcześniejszych badań zidentyfikowałam i scharakteryzowałam aktywną w niskiej temperaturze esterazę z Pseudomonas sp. S9. Esteraza Pseudomonas sp. S9 jest przykładem białka dwudomenowego składającego się z domeny katalitycznej i domeny autotransportera. Białko to produkowane było w systemie E. coli w postaci nieaktywnej tj. w ciałkach inkluzyjnych i wymagało renaturacji. System ekspresyjny E. coli nie sprawdził się w pełni do produkcji esterazy z Pseudomonas sp. S9. W związku z tym postanowiono wykorzystać inny system ekspresji w celu otrzymania aktywnego białka produkowanego na zewnątrz komórki. W pracy wykorzystano system ekspresyjny oparty o komórki mezofilnych drożdży Pichia pastoris. Etapy badań obejmowały konstrukcję drożdżowych wektorów ekspresyjnych umożliwiających produkcję dwóch wariantów rekombinantowych białek tj. białka jednodomenowego (domena katalityczna) oraz dwudomenowego (domena katalityczna i autotransporter). Ponadto, wektory skonstruowano tak by otrzymane białka rekombinantowe na N-końcu posiadały sekwencje sygnalne (α faktor), a na C-końcu domenę polihistydynową umożliwiająca efektywne oczyszczanie przy użyciu chromatografii metalopowinowactwa. W wyniku elektroporacji komórek Pichia pastoris skonstruowanymi wektorami ekspresyjnymi otrzymano szczepy rekombinantowe produkujące białka zarówno jednodomenowe jak i dwudomenowe. W odróżnieniu od białka jednodomenowego (αEstS9) produkowanego na zewnątrz komórki wariant dwudomenowy białka (αEstS9Auto) kotwiczy w błonie komórkowej komórek drożdży Pichia pastoris X-33. Wynik ten potwierdza funkcję domeny autotransportera. Przeprowadzona charakterystyka biochemiczna enzymu jednodomenowego (EstS9) wykazała jego odmienność w stosunku do białka dwudomenowego produkowanego w E. coli. Odnotowano różnice m.in w specyficzności substratowej i zakresie temperatur w jakich to białko najlepiej działa.

Authors (6)