Abstract

W rozprawie doktorskiej celu opracowania wydajnej metody produkcji rekombinantowych wariantów sekwencyjnych enzymu esterolitycznego z psychrotolerancyjnego szczepu Pseudomonas sp. S9 zaprojektowano układy ekspresyjne umożliwiające ich produkcję w bakteriach Escherichia coli oraz drożdżach Pichia pastoris. W systemie ekspresyjnym E. coli wyprodukowano dwa warianty białek: EstS9Auto (białko zbudowane z domeny katalitycznej, domeny autotransportera, domeny oligohistydynowej) i EstS9short (białko zbudowane z domeny katalitycznej i domeny oligohistydynowej). Oba warianty białek, tj. EstS9Auto i EstS9short, produkowane były w systemie E. coli w postaci nieaktywnej, w ciałkach inkluzyjnych. W związku z powyższym, otrzymanie preparatów obu białek umożliwiających oznaczenie ich właściwości enzymatycznych wymagało przeprowadzenia oczyszczania tychże białek w warunkach denaturujących, z zastosowaniem chromatografii metalopowinowactwa, a następnie przeprowadzenia procesu renaturacji. W dalszych etapach pracy przeprowadzono charakterystykę biochemiczną rekombinantowego enzymu EstS9Auto, a także porównano jego aktywność enzymatyczną z uzyskanym preparatem jednodomenowego wariantu esterazy - EstS9short. W związku z pojawiającym się problemem produkcji obu enzymów w formie ciał inkluzyjnych w komórkach E. coli, pracę rozszerzono o przetestowanie innego układu ekspresyjnego, tym razem opartego o zastosowanie mezofilnych drożdży Pichia pastoris jako gospodarza ekspresji heterologicznych genów. Zaprojektowane układy ekspresyjne umożliwiły uzyskanie dwóch rekombinantowych białek, tj. αEstS9Auto i αEstS9short. Charakterystykę biochemiczną przeprowadzono tylko dla białka rekombiantowego αEstS9short, gdyż tylko w tym wypadku uzyskano sekrecję białka na zewnątrz komórek drożdży. Dzięki użyciu dwóch różnych systemów ekspresyjnych udało się osiągnąć cel pracy jakim było m.in. porównanie charakterystyki enzymatycznej dwóch różnych wariantów sekwencyjnych esterazy pochodzącej z psychrotolerancyjnych bakterii Pseudomonas sp. S9. Ponadto, porównano właściwości obu enzymów z właściwościami biochemicznymi innych opublikowanych aktywnych w niskiej temperaturze esteraz.

Author (1)