Abstrakt

A DNA fingerprinting method known as ALIS-FLP (amplified ligation selected fragment-length polymorphism) has been developed for selective and specific amplification of restriction fragments from TspRI restriction endonuclease digested genomic DNA. The method is similar to AFLP, but differs in that only one specific restriction enzyme (TspRI) is used. The cohesive ends of the DNA fragments are ligated with two types of oligonucleotide. A long oligonucleotide containing the primer site and the specific 9 nt 3 prime end, which is complementary to specific 9 nt, cohesive 3 prime end of the TspRI genomic DNA fragment, and a short, degenerated, oligonucleotide covering the remaining TspRI cohesive ends. Other cohesive ends are covered by a short degenerated oligonucleotide lacking the primer site. The ligation mixture is used as a template for amplification using a single primer corresponding to the 5 prime end of the long, specific oligonucleotide. The selection of TspRI digested genomic DNA fragments for amplification is achieved by sequence selective ligation of the specific long oligonucleotide carrying the primer site to both ends of the specific target fragment. This technique allows for differentiation of the organisms without previous knowledge of their DNA sequence. The usefulness of the method is confirmed by genotyping of 70 previously characterized clinical E. coli isolates. The grouping obtained was identical to the results of REA-PFGE. Versatility of the method is highlighted, i.e. its combining the advantages of the AFLP technique with a simple, rapid and cheap polymerase chain reaction product detection method.ALIS-FLP (Amplified Ligation Selected Fragment Length Polymorphism) jest nową metodą genotypowania wykorzystującą własności restrykazy TspRI. W wyniku cięcia genomowego DNA generowane są małe fragmenty DNA o dziewięcionukleotydowych lepkich końcach. Zastosowanie odpowiednio zaprojektowanych oligonukleotydów pozwala na selektywną ich ligację z fragmentami restrykcyjnymi i ogranicza ilość fragmentów, które ulegają amplifikacji w reakcji PCR. Rozdział produktów odbywa się z użyciem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Metoda ta została przetestowana na siedemdziesięciu klinicznych szczepach Escherichia coli i wyróżniła trzydzieści sześć genotypów. Klasyfikacja poszczególnych izolatów była identyczna z klasyfikacją otrzymaną z użyciem metody REA-PFGE (restriction analysis-pulsed field gel electrophoresis). Opracowana metoda ALIS-FLP jest powtarzalna, zastosowanie jej jest możliwe w standardowo wyposażonym laboratorium diagnostyki molekularnej, a interpretacja jej wyników jest jednoznaczna, może więc być stosowana w badaniach epidemiologicznych izolatów Escherichia coli.

Autorzy (6)