Abstract

Badania ekspresji rekombinantowej alfa-amylazy izolowanej z Escherichia coli BL21(DE3)pLysS transformowanej plazmidem pTYB2alfa-Amyl wykazały, że około 49 % wytwarzanego enzymu występuje w postaci ciałek inkluzyjnych. Źródłem genu termostabilnej alfa-amylazy był szczep Pyrococcus woesei (DSM 3773). W celu uzyskania aktywnych białek z ciałek inkluzyjnych odwirowane komórki bakterii inkubowano w roztworze CaCl2 i po trawieniu lizozymem zawieszano w 0,02 M Tris-HCl (pH 8,0) zawierającym 10 mM EDTA. Sferoplasty z komórek E. coli poddano lizie w 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) zawierającym 0,05 % Tritonu X-100, 10 mM EDTA i 10 mM beta-merkaptoetanolu. Ciałka inkluzyjne odwirowywano (12000xg, 15 min) w skokowym gradiencie stężenia sacharozy i rozpuszczano w 6 M wodnym roztworze mocznika. Udział aktywności rozpuszczalnej formy rekombinantowego enzymu w ogólnej aktywności lizatu komórek E. coli BL21(DE3)pLysS transformowanej plazmidem pTYB2alfa-Amyl wynosi ponad 51 %. Wytwarzane ciałka inkluzyjne zachowują aktywność enzymatyczną. Odniesiona do 1 g biomasy aktywność amylolityczna ekstraktu ciałek inkluzyjnych pochodzącego z odrębnych hodowli E. coli zawierającej plazmid pTYB2alfa-Amyl wynosiła 996,6 i 587,8 U, przy zachowaniu podobnej aktywności specyficznej enzymu wynoszącej około 9,5 U/mg białka. Zastosowana procedura oczyszczania rekombinantowej alfa-amylazy z ciałek inkluzyjnych spowodowała około 3-krotny wzrost aktywności preparatu w porównaniu z lizatem komórek. Ekstrakcja ciałek inkluzyjnych ze sferoplastów E. coli umożliwiła uzyskanie preparatu termostabilnej alfa-amylazy o aktywności wystarczającej do niektórych zastosowań przemysłowych.

Authors (3)