Specjalność: Biotechnologia molekularna (WCh), II stopnia, stacjonarne

Prowadzący wykład: dr hab. Beata Krawczyk, prof. uczelni - stacjonarnie na uczelni

Prowadzący laboratoria: dr hab. Beata Krawczyk, prof. uczelni - zajęcia stacjonarne na PG, sala 304 WCH B.

Kontakt: (58) 347-23-83

Beata Krawczyk (wykłady): e-mail: beata.krawczyk@pg.edu.pl; WCH B; p.217;

Konsultacje: stacjonarnie we wtorki o godzinie 13. 

Opis kursu

Kurs dotyczy technik amplifikacji kwasów nukleinowych, zarówno tych związanych z amplifikacją matrycy, jak i tych stosowanych w amplifikacji sygnału czy sondy. Poza metodyką związaną z praktycznym stosowaniem różnych metod, omówione zostaną przykłady zastosowań różnych technik. 

Zasady zaliczenia przedmiotu:

WYKŁAD

• wykład na uczelni, obecność obowiązkowa (dozwolona 1 nieobecność na zajęciach)
• zaliczenie wykładu w formie testu
• próg zaliczenia dla wykładu - 60%
• wykład stanowi 50% składowej oceny końcowej

LABORATORIA

• obecność na laboratoriach jest obowiązkowa
• sprawozdania (forma do ustalenia z prowadzącym) oraz zadanie
• próg zaliczenia dla laboratorium - 60%
• laboratoria stanowią 50% składowej oceny końcowej przedmiotu

Szczegółowy program

Wykłady: Dodatnie strony testów opartych o kwasy nukleinowe (NAT). Metody amplifikacji targetu. Organizacja laboratorium amplifikacji kwasów nukleinowych Historia techniki PCR. Zasada działania (pracy) PCR, kinetyka reakcji, pierwsze kroki w nastawianiu PCR, analiza produktów amplifikacji. Podstawy PCR – reagenty i urządzenia do PCR (termocyklery): matryce do PCR (kwasy nukleinowe), odczynniki (dNTP, Mg2+), bufory do PCR –skład, startery oligonukleotydowe, polimerazy do PCR (właściwości). Przygotowanie matrycy do PCR i inhibitory. Optymalizacja PCR. Rozwiązywanie problemów, substancje wpływające na efektywność PCR: inhibicja i wzmacnianie. HOT-start PCR. Touchdown PCR. Strony dodatnie stosowania PCR i ograniczenia (problemy z kontaminacją, zwalczanie i zapobieganie, kontrole w reakcji PCR). Poprawa specyficzności reakcji PCR. Wewnętrzny (zagnieżdżony) PCR (nested PCR) podnosi czułość reakcji. Złożony PCR (multiplex PCR). Asymetryczny PCR w przygotowywaniu ssDNA do sekwencjonowania. Analiza ekspresji genów w wykorzystaniem RT-PCR, semi-ilościowy i ilościowy PCR. Kompetytywny PCR. Allelo-specyficzna amplifikacja (ASA). Szybka amplifikacja końców cDNA (RACE). Metoda T-RFLP do badania mikroorganizmów środowiskowych. Podstawy Real-time PCR. Genotypowanie z zastosowaniem RAPD (przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA). Metody oparte o ligację adaptorów oligonukleotydowych i PCR (LM PCR). Technika LAMP. Zróżnicowana liczba tandemowych powtórzeń w badaniach tożsamości. Zastosowanie PCR w diagnostyce molekularnej Alternatywne techniki amplifikacji kwasów nukleinowych (NASBA, TMA, SDA, MDA, OLA). Zastosowanie polimerazy Phi29. Metody amplifikacji sygnału (bDNA, hybryd capture assay) i metody amplifikacji sondy.

Laboratoria: Strategia optymalizacji reakcji PCR: optymalizacja temperatury przyłączania starterów, stężenia DNA - badanie czułości reakcji, optymalizacja dNTP i Mg²⁺, składu buforu do PCR. Badanie substancji wpływających na PCR: inhibitory i wzmacniacze. Inhibicja pochodząca od odczynników podczas izolacji DNA (proteinaza, fenol, SDS, EDTA, materiał biologiczny-krew). Efekt inhibicji określonego stężenia SDS na aktywność polimerazy i znoszenie działania hamującego SDS przez Tween20. Ocena efektywności działania wzmacniaczy (podnoszenie wydajności PCR z użyciem odpowiedniego panelu wzmacniaczy) Multiplex PCR - wykrywanie dwóch różnych regionów genomu w jednej probówce - optymalizacja.